M-MLV 逆转录酶

产品说明

M-MLV逆转录酶是由一个 71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。。。。。？梢源呋RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。。。。。本酶经修饰RNase H活性比通俗的逆转录酶要弱许多，，因此在合成第一链cDNA的历程中，，可包管RNA的降解水平较低，，从而使得率提高。。。。。

产品组分

R1041可举行25次逆转录反应，，R1042可举行50次逆转录反应（20 μl 标准 PCR 反应系统，，每次使用 M-MLV 1 μl）。。。。。

M-MLV 贮存液因素

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，，200 mM NaCl，，0.1 mM EDTA，，1 mM DTT，，0.01% NP-40，，50% glycerol

5x first-strand buffer 因素

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，，375 mM KCl，，15 mM MgCl₂，，50 mM DTT

生涯条件

-20℃生涯，，阻止重复冻融。。。。。

质量检测

逆转录酶活性检测

使用[₃₂P]dCTP作为标记，，200 U的M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA为模板举行逆转录反应，，最低可获得120 ng的cDNA，，所得cDNA长度 > 全长的90%。。。。。

核酸外切酶活性检测

混淆50 ng的标记DNA或RNA与200 U M-MLV在1×反应缓冲液系统中，，37℃温浴1 h，，检测DNA和RNA降解都不到总量的1%。。。。。

核酸内切酶活性检测

混淆1μgⅠ型超螺旋质粒DNA与500 U M-MLV在1×反应缓冲液系统中，，37℃温浴1 h，，琼脂糖电泳检测，，无显着的剪切。。。。。

适用规模

第一链cDNA 合成；；；；cDNA 文库构建；；；；RT-PCR；；；；引物延伸；；；；3' 和 5' RACE。。。。。

注重事项

l  乐成的cDNA合成来自高质量的RNA。。。。。高质量的RNA至少应包管全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂，，如EDTA或 SDS。。。。。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC举行处置惩罚，，并在高压灭菌后使用。。。。。有些试剂不可用高压灭菌处置惩罚时，，首先用经由灭菌的用具、水等配制溶液后，，再将溶液举行过滤除菌处置惩罚。。。。。

l  为了增添贮存RNA样品的稳固性，，可以将RNA消融在去离子的甲酰胺中，，存于-70℃。。。。。用于生涯 RNA 的甲酰胺一定不可含有降解RNA的杂物。。。。。泉源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中生涯一年。。。。。当准备使用RNA时，，可以使用下列要领沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同时加入4倍体积的乙醇，，室温安排3-5 min，，10,000 rpm离心5 min。。。。。

l  在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂（RNasin）以增添cDNA合成的长度和产量。。。。。在第一链合成反应中，，RNase抑制剂在缓冲液和还原剂（如 DTT）保存的条件下加入，，由于cDNA合成前的历程会使抑制剂变性，，从而释放出RNase。。。。。可是RNase抑制剂仅避免RNase A，，B，，C 对RNA的降解，，并不可避免皮肤上的RNase，，因此只管使用了RNase抑制剂，，也要小心不要从手指上引入RNase。。。。。

l  较高的保温温度有助于RNA二级结构的翻开，，增添反应的产量。。。。。

l  使用简朴的RNA纯化要领即可获得知足RT-PCR反应的RNA，，但为了包管实验的乐成率，，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。。。。。

l  为避免RNA降解，，应只管阻止重复冻融，，最好生涯于-70℃。。。。。

l  最佳的PCR反应条件，，因PCR扩增仪的差别而差别，，以是在使用您的样品之前最好先试做一下control反应，，以确定最佳的PCR反应条件。。。。。

l  cDNA产品应置于-20℃生涯。。。。。

l  当以cDNA为模板举行PCR之前，，使用RNase H处置惩罚cDNA，，可以提高PCR反应的迅速度。。。。。

操作办法

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混淆物

2 举行变性退火反应

70℃温浴5 min，，简短离心后冰浴5 min。。。。。

3 在上述离心管中配制反转录反应液

4 按下列条件举行反转录反应

Oligo (dT)₁₅ ：42℃温浴60 min；；；；

Random primer： 37℃温浴60 min。。。。。

5 终止反应

70℃温浴5 min终止反应，，置冰上举行后续实验或-20℃生涯。。。。。

6 用RNase-free ddH₂O将反应系统稀释到50μl，，取2-5μl举行PCR扩增反应。。。。。