TRAzol

产品说明

TRAzol可以从动物组织、植物质料、种种微生物以及作育细胞等组织质料中提取总RNA。。。样品在TRAzol中能够充分被裂解，，，，在加入氯仿离心后，，，，溶液会形成上清层、中心层和有机层（下层），，，，RNA漫衍在上清层中，，，，网络上清层后，，，，经异丙醇沉淀便可以接纳获得总RNA。。。经本制品提取的总RNA纯度高，，，，基本不含卵白质及基因组DNA，，，，提取的RNA可以直接用于Northern杂交、黑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA剖析酶的
；；；て饰觥RT-PCR、构建cDNA文库等种种分子生物学实验。。。

产品组分

需要自备氯仿、异丙醇、RNase-free 75%乙醇、DEPC处置惩罚水（R2041/R2042）

生涯条件

室温运输，，，，2-8℃避光生涯。。。

注重事项

●   TRAzol具有侵蚀性，，，，操作历程中应做好防护，，，，阻止直接接触皮肤或吸入口鼻。。。沾染后应连忙用大宗清水冲洗，，，，须要时请就医处置惩罚。。。

●   严防操作情形、使用的容器、耗材和试剂的RNase污染。。。操作历程中勤换手套。。。

●   凭证起始质料量的差别使用差别体积的溶液（见下表）。。。过多或过少的使用量都可能影响RNA的质量或产量。。。若起始质料量很少，，，，RNA预计产量很低，，，，在异丙醇沉淀时，，，，可加入20 mg/ml肝糖原溶液0.5-1 μl增进RNA沉淀。。。

●   差别起始质料试剂用量及TRAzol用量。。。

●   使用本产品提取的RNA一样平常不含有DNA污染。。。在少少数情形下（与组织pH值等相关），，，，若是有DNA污染而又必需去除，，，，则可以用RNase-free的DNase处置惩罚样品。。。

●   避免DNA污染要领：a. 镌汰样本起始用量，，，，如将100 mg的植物组织镌汰为50 mg，，，，将30 mg的动物组织镌汰为10 mg
；；；

                      b. 在加入TRAzol之后加入5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。。。

●   请严酷遵照操作办法操作。。。

●   有关RNA的吸光度说明如下：

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度划分代表了核酸、配景（溶液污浊度）、盐浓度和卵白质等有机物的吸光度值。。。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）体现了RNA中的卵白质等有机物的污染水平，，，，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.0之间，，，，当R<1.8时，，，，溶液中的卵白质等有机物的污染较量显着
；；；当R>2.2时，，，，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。。。在对核酸举行吸光度检测时，，，，需要注重稀释液应使用TE Buffer。。。

●   RNA浓度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）×稀释倍数×0.04 μg/μl

操作办法

1.      实验样品的研磨和匀浆

A. 贴壁作育细胞

倒出作育液，，，，用1X PBS洗濯一次，，，，每10 cm²生长的作育细胞中加入1ml的TRAzol，，，，水平安排片晌，，，，使裂解液匀称漫衍于细胞外貌并裂解细胞，，，，然后使用移液枪奏乐细胞使其脱落（关于贴壁牢靠的作育细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。。。将内含细胞的裂解液转移至离心管中，，，，用移液枪重复吹吸直至裂解液中无显着沉淀。。。室温静置5 min。。。

B. 悬浮作育细胞

将悬浮作育细胞连同作育液一起倒入离心管中，，，，8,000 rpm，，，，4℃离心2 min，，，，弃上清，，，，向每10⁷个细胞中加入l-2 ml的TRAzol。。。用移液枪重复吹吸直至裂解液中无显着沉淀，，，，室温静置5 min。。。

C. 动物组织、植物质料样品

将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，，，，用研杵研磨组织，，，，其间一直加入液氮，，，，直至研磨成粉末状（无显着的可见颗粒，，，，若是没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。。。关于通俗的RNA提取样品，，，，可以向研钵中加入适量的TRAzol，，，，将研磨成粉末状的样品完全笼罩，，，，然后室温静置，，，，直至样品完全融化，，，，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。。。关于特殊样品，，，，如肝、脾、骨及软骨等，，，，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的TRAzol的匀浆管中，，，，把匀浆管置于冰浴中举行匀浆，，，，直至匀浆液呈无颗粒透明状。。。将匀浆液转移至离心管中，，，，室温静置5 min。。。12,000 rpm 4 ℃离心5 min，，，，小心吸收上清液，，，，移入新的离心管中（切勿吸收沉淀）。。。

2.      Total RNA的提取

1  向上述办法中的匀浆裂解液中加入氯仿（TRAzol的1/5体积量），，，，盖紧离心管盖，，，，用力振荡（氯仿沸点低、易挥发，，，，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。。。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相征象）后，，，，再室温静置2 min。。。

2  12,000 rpm 4 ℃离心10 min。。。

3  从离心机中小心取出离心管，，，，此时匀浆液分为三层，，，，即：无色的上清液、中心的白色层及带有颜色的下层有机相，，，，吸收上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中心层）。。。

（如样品含有较多多糖多酚，，，，请增添以下办法：在上清液中加入0.2X上清液体积的5 M NaCl及1X上清液体积的酚/氯仿（1:1），，，，混匀，，，，12000 rpm离心5-10 min ，，，，取上清液加入等体积氯仿，，，，混匀，，，，12000 rpm 离心 5-10 min，，，，至第4步。。。）

4  向上清中加入等体积的异丙醇，，，，上下倒置离心管充分混匀后，，，，在15-30℃下静置10 min。。。

5  12,000 rpm 4℃离心10 min。。。一样平常在离心后，，，，试管底部会泛起沉淀。。。

3.      RNA沉淀的洗濯

小心弃去上清，，，，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1 ml（切勿触及沉淀），，，，轻轻上下倒置洗涤离心管管壁，，，，12,000 rpm，，，，4 ℃离心2 min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，，，，应只管除净乙醇），，，，重复洗涤一次。。。

4.      RNA的消融

室温干燥沉淀2-5 min（不可以离心或加热干燥，，，，不然RNA将会很难消融），，，，加入适量的RNase-free水消融沉淀，，，，须要时可用移液枪轻轻奏乐沉淀，，，，待RNA沉淀完全消融后于-80℃生涯。。。