若是失慎爆发污染情形，，应从下面几条出发，，逐一剖析，，扫除污染。
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（1）设立阴阳性比照：有利于监测反应系统各因素的污染情形。
。。。。选择阳性比照时，，应选择扩增弱，，且重复性好的样品，，因强阳性比照可爆发大宗不须要的扩增序列，，反而可能成为潜在的污染源。
。。。。若是以含靶序列的重组质粒为比照，，100个拷贝之内的靶序列就足以爆发阳性扩增。
。。。。阴性比照的选择亦要稳重，，由于PCR敏感性极高，，可以从其它要领（Sourthern 印；；；；虻阍咏坏龋┘觳庖跣缘谋瓯局屑觳獬黾⒘康陌蟹肿。
。。。。别的，，每次扩增均应包括PCR系统中各试剂的时机比照，，即包括PCR反应所需的所有因素，，而不加模板DNA，，这对监测试剂中PCR产品残留污染是很是有益的。
。。。。若是扩增效果中试剂比照为阳性效果，，就是某一种或数种试剂被污染了。
。。。。此时，，要所有替换一批新的试剂举行扩增，，扩增时设立差别的反应管，，每一管含有一种被检测试剂，，在检出污染试剂后，，应马上处置惩罚。
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（2）情形污染：在扫除试剂污染的可能性外，，替换试剂后，，若不久又发明试剂被污染了，，若是预防步伐较量严密，，则思量可能为情形污染。
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情形污染中常见的污染源主要有：
  ①  模板提取时真空抽干装置；；；；
  ②  凝胶电泳加样器；；；；
  ③  电泳装置；；；；
  ④  紫外剖析仪；；；；
  ⑤  切胶用刀或手术刀片；；；；
  ⑥  离心机；；；；
  ⑦  冰箱门把手，，冷冻架，，门把手或实验台面等；；；；
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。
。。。。用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；；；；0.1ml去离子水浸泡；；；；取5ml做PCR实验；；；；电泳检测效果。
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  ⑧  气溶胶。
。。。。若是经由上述追踪实验，，仍不可查找到确切污染源，，则污染可能是由空气中PCR产品的气溶胶造成的，，此时就应该替换实验场合，，若条件不允许，，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
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 确定污染源后怎样处置惩罚？？？？

（1）情形污染
1. 稀酸处置惩罚法：对可疑用具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，，使剩余DNA脱嘌呤；；；；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一样平常选择254/300nm，，照射30min即可。
。。。。需要注重的是，，选择UV作为消除残留PCR产品污染时，，要思量PCR产品的长度与产品序列中碱基的漫衍，，UV照射仅对500bp以上长片断有用，，对短片断效果不大。
。。。。UV照射时，，PCR产品中嘧啶碱基会形成二聚体，，这些二聚体可使延伸终止，，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，，且UV照射还可使二聚体断裂。
。。。。形成二聚体的水平取决于UV波长，，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。
。。。。在受照射的长DNA链上，，形成二聚体缺陷的数目少于0.065/碱基，，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，，胸腺嘧啶乙二醇，，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。
。。。。这些位点的数目与二聚体位点相当。
。。。。若是这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机漫衍，，一个500bp片断的DNA分子链上将有32处损伤位点，，那么，，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。
。。。。相反，，若是100bp的片断，，每条链上仅有6处损伤，，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。
。。。。这就是UV照射有一定的片断长度限制的缘故原由。
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（2）反应液污染 
可接纳下列要领之一处置惩罚：
1. DNase I法：PCR混淆液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，，室温反应30 min后加热灭活，，然后加入模板和Taq聚合酶举行正常PCR扩增。
。。。。该要领的优点是不需要知道污染DNA的序列；；；；
2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），，可同时选择几种，，以战胜用一种酶只能识别特定序列的缺陷，，室温作用1h 后加热灭活举行PCR；；；；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混淆液举行紫外照射，，注重事项与要领同上述UV照射法；；；；
4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破损0.1ng基因组DNA，，2.0 kGy可破损104拷贝的质粒分子，，4.0 kGy仍不影响PCR，，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。
。。。。引物可受照射而不影响PCR，，g射线是通过水的离子化爆发自由基来破损DNA的。
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（3）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片断效果欠好，，而临床用于检测的PCR扩增片断通常为300bp左右，，因此UNG的预防作用日益受到重视和一定。
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1. 原理：在PCR产品或引物中用dU 取代dT。
。。。。这种dU化的PCR产品与UNG一起孵育，，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，，从而失去被再扩增的能力。
。。。。UNG对不含dU的模板无任何影响。
。。。。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，，而对RNA中的尿嘧啶和简单尿嘧啶分子则无任何作用。
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2. dUTP法：用dUTP取代dTTP，，使产品中掺入大宗dU。
。。。。在再次举行PCR扩增前，，用UNG处置惩罚PCR混淆液即可消除PCR产品的残留污染。
。。。。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，，因此不会影响含dU的新的PCR产品。
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3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，，这样PCR产品中仅5ˊ端带dU。
。。。。UNG处置惩罚后，，引物失去了连系位点而不可扩增。
。。。。对长片断（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，，而用dU法就可战胜这一弱点。
。。。。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。
。。。。该法仅能用于引物以外试剂的处置惩罚。
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4. 优点：可以去除任何泉源的污染；；；；UNG处置惩罚可以和PCR扩增在统一个反应管内举行；；；；由于扩增产品中有大宗dU保存，，可彻底消除污染源。
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5. 需注重的是掺入dUTP的DNA不应对产品的任何操作有影响，，在举行PCR产品克隆时，，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，，不然转化产品会被受体菌UNG消化掉。
。。。。                                                                                     （4） 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，，杂交区域是非扩增区；；；；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，，通过漂洗可去除污染的扩增产品和杂质；；；；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。
。。。。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产品或重组质粒污染。
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（5）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，，该法可显着降低假阳性而不影响PCR的敏感性。
。。。。其要害在于设计引物，，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。
。。。。与mRNA逆转录后，，经超速离心使 cDNA与多余引物脱离，，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C举行扩增添尾cDNA，，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。
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（6）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。
。。。。这一区域只保存完整的原病毒中，，在重组质粒中，，这一区域分成两个区域与克隆位点被。
。。。。若是重组质粒污染了标本，，也不可扩增出任何条带，，纵然泛起了扩增带，，其巨细也与预期的差别。
。。。。只有原病毒DNA才华被引物扩增，，因此只要泛起预期巨细的扩增带就可以证实标本是阳性的，，该法试用于环状靶分子系列。
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